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測序發現引物有突變?

發布日期:2020/7/23 10:33:29 閱讀次數:430次

測序發現引物區域有突變,特別是40個堿基以下的引物, 發生的概率不大,但是肯定也會發生。發生這種突變的原因有很多解釋,人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣,采用的機器也基本相同,合成主要原料都是由可數的幾家跨國公司提供的,所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似,沒有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學反應,合成效率*也就是99%,副產品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復,一般認為,偶連過程中,正在偶連的部分單體發生丟失DMT,導致單體又接了上去,故發生插入同一堿基的突變。至于缺失突變,一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不徹底造成的,Caping反應主要是封閉極少數5′-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物,在下一輪偶連時將不能繼續參與合成。對于堿基置換的突變,產生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護,即引物上可能含有殘留保護基團,引物的這些區域不能很好地與互補鏈配對,當擴增的產品被亞克隆轉化到大腸桿菌中,可能被細菌中修復系統補上了非配對的堿基。置換突變通常發生在G 轉換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉化為烯醇異構體 (脫嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA復制和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A,測序就會發現堿基G-A置換。脫嘌呤現象在富含嘌呤的引物中發生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解,測序就會發現堿基G或A的缺失。

引物合成過程中,造成堿基插入,缺失,置換突變的因素客觀存在,有不少降低發生的頻率建議和措施,但是這些措施還停留在實驗室階段,還沒有能夠應用到規;a中。

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